1、藻類(lèi)檢測(cè)和計(jì)數(shù)新方法——置式顯微鏡法

由于環(huán)境污染，一些湖泊富營(yíng)養(yǎng)化程度不斷加劇，導(dǎo)致水中藻類(lèi)的快速增長(zhǎng)。大量藻類(lèi)的存在，直接影響了自來(lái)水的生產(chǎn)和供應(yīng)。為了了解藻類(lèi)對(duì)水廠各工藝環(huán)節(jié)的影響，以湖泊水為水源的許多水廠都相繼開(kāi)展了藻類(lèi)計(jì)數(shù)檢測(cè)項(xiàng)目。國(guó)內(nèi)普遍采用的方法是將1L水樣加魯戈試劑固定在一個(gè)容器中，自然沉降24h后，利用虹吸的方法吸去上清液，并濃縮定容到30～50mL，然后取1mL放入血球計(jì)數(shù)板，在正置式顯微鏡下進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)[1]。此方法由于所需的水樣較多（1L），在需要采集多個(gè)水樣時(shí)，采集和運(yùn)送的工作量大;在沉樣時(shí)還要多次沖洗轉(zhuǎn)移，增加了產(chǎn)生誤差的機(jī)會(huì)，而且操作不便。昆明自來(lái)水總公司的水源之一是富化程度較高的滇池水，因而昆明水司較早開(kāi)展了此項(xiàng)目，并得到了瑞士蘇黎世供水局的技術(shù)支持和大力幫助。我們所采用的藻類(lèi)計(jì)數(shù)方法的特點(diǎn)是使用倒置式顯微鏡，藻樣通過(guò)沉樣板一步沉降到位，與國(guó)內(nèi)普遍采用的方法相比具有準(zhǔn)確快捷，水樣用量少，運(yùn)送方便，無(wú)須多次沖洗轉(zhuǎn)移，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于生產(chǎn)和科研檢測(cè)。

1.用品準(zhǔn)備

（1）沉樣板。由一個(gè)長(zhǎng)12cm，寬4.1cm,中央有圓形凹槽（底面積為5cm2）的長(zhǎng)方形有機(jī)玻璃板和一個(gè)可滑動(dòng)的、底部與凹槽形狀完全吻合的空心圓筒（容積為25mL）以及一塊圓形蓋玻片組成（見(jiàn)圖1），有機(jī)玻璃板的左側(cè)有一小孔，用于放掉上清液。

（2）倒置式顯微鏡。與普通倒置式顯微鏡不同的是，它的載物臺(tái)經(jīng)簡(jiǎn)單改造，增加了一個(gè)長(zhǎng)方形的金屬框，大小恰好可放置沉樣板。金屬框的作用是將沉樣板固定在載物臺(tái)上，使沉樣板可與載物臺(tái)同步移動(dòng)，避免沉樣板發(fā)生偏移。兩個(gè)目鏡，一個(gè)裝有微型刻度尺，可直接測(cè)量藻類(lèi)的大小和長(zhǎng)度，另一個(gè)裝有“??”形標(biāo)尺，在訐數(shù)時(shí)用它界定訐數(shù)范圍。

（3）250mL試劑瓶。用于盛裝水樣。

（4）移液管（1～25mL）。

2.藥品準(zhǔn)備

①魯戈試劑（Lugols?Solution）;②福爾馬林（40%）;③灑精（50％）。

3.方法與步驟

3.1取樣

先在250mL試劑中加入6～7滴魯戈劑，再加入200mL，左右水樣，搖勻。如果水樣需保存較長(zhǎng)時(shí)間，可加入適量福爾馬林（40％）。

3.2沉降

用移液管取適量水樣加入沉樣板，再加入蒸餾水至滿(mǎn)，加蓋圓玻片，靜沉24h。取多少水樣，同藻類(lèi)的多寡而定，藻類(lèi)數(shù)量多可少取，數(shù)量少可多取，一般水樣體積在1~25mL之間。

3.3計(jì)數(shù)

將沉樣板上的圓筒用蓋玻片推開(kāi)，放掉上清液，置于顯微鏡上，以目鏡上的“工工”形標(biāo)尺為界線，隨機(jī)選取若干條帶計(jì)數(shù)。

一般情況是這樣計(jì)數(shù)的；①在10×16倍鏡頭下，計(jì)數(shù)全部視野（1cm2）內(nèi)的大型藻類(lèi)。②在×25的倍鏡下，隨機(jī)選取5條帶，計(jì)數(shù)基中的中型藻類(lèi)。③在10×40倍的鏡頭下，隨機(jī)選取1條帶，計(jì)數(shù)其中的微型藻類(lèi)。

在實(shí)際運(yùn)用中，可根據(jù)當(dāng)?shù)氐脑孱?lèi)情況，確定所選取的條帶數(shù)。

3.4計(jì)算

N=?

式中N?——1mL;

5——沉樣板板底部圓形凹槽的底面積，cm2;

S——每個(gè)計(jì)數(shù)條帶的面積，cm2;

A——選取的條帶數(shù)；

V——水樣體積；mL;

N——實(shí)際數(shù)的A個(gè)條帶的藻類(lèi)個(gè)數(shù)。

將上述三個(gè)放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)得的藻類(lèi)依上式分別計(jì)算，再相加，即得到藻類(lèi)總數(shù)。

3.5清洗

計(jì)數(shù)完畢，用蒸留水沖洗沉樣板，浸泡于50％的酒精中過(guò)認(rèn)，再次用蒸留水沖洗后，晾干待用。

4.注意事項(xiàng)

（1）沉樣前，要將水樣搖勻

（2）將沉樣板的圓筒推開(kāi)時(shí)，要防止產(chǎn)生氣泡。

（3）將沉樣板置于顯微鏡上時(shí)，要盡量保持平衡，避免藻類(lèi)向一側(cè)傾斜。

（4）在選取計(jì)條帶時(shí)，既要注意隨機(jī)性，又要注意均勻性。

5.實(shí)際樣品檢測(cè)

取某水廠原水用上述方法（簡(jiǎn)稱(chēng)倒置法）和國(guó)內(nèi)普遍采用的傳統(tǒng)方法（簡(jiǎn)稱(chēng)正置法）分別進(jìn)行藻類(lèi)檢測(cè)和計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，倒置法水樣用量少，并有較高的精密度；正置法水樣用量多，精密度較低，而且由于正置法使用的血球計(jì)數(shù)的容積所限（0.1m3），出現(xiàn)在計(jì)數(shù)框內(nèi)的藻類(lèi)種類(lèi)也有限，如果需要分類(lèi)計(jì)數(shù)，有一定局限性，不好操作。倒置法可以一邊分類(lèi)鑒定，一邊分類(lèi)計(jì)數(shù)，水樣中存在的種類(lèi)在1cm2的計(jì)數(shù)范圍內(nèi)基本都能看到，分類(lèi)鑒定和計(jì)數(shù)的結(jié)果比較全面，操作也方便。另外，倒置法將水樣一步沉降到位，省略了許多中間環(huán)節(jié)，減少了多次沖洗?轉(zhuǎn)移帶來(lái)的操作誤差，從而提高了準(zhǔn)確度。

6結(jié)論

利用倒置式顯微鏡進(jìn)行藻類(lèi)檢測(cè)和計(jì)數(shù)的方法，比使用正置式顯微鏡的血球計(jì)數(shù)板法水樣用量少，中間環(huán)節(jié)少，準(zhǔn)確快捷，精密度較高，在分類(lèi)鑒定和計(jì)數(shù)時(shí)，操作較為方便。但該方法使用的沉樣板國(guó)內(nèi)尚無(wú)廠家生產(chǎn)，需要從國(guó)外購(gòu)買(mǎi)。

二、改進(jìn)的水中藻類(lèi)檢測(cè)方法

水中藻類(lèi)傳統(tǒng)的測(cè)定方法是將一定量的水樣加魯哥試劑因定，在筒型分液漏斗中進(jìn)行自然沉淀，48h后，借助虹吸方法吸去上層清液，按要求濃縮定容到30—50ml，然后在鏡下計(jì)數(shù)，由于固定沉降時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果常滯后于生產(chǎn)和研究，影響了及時(shí)分析和解決問(wèn)題。為了解決這一問(wèn)題，下文對(duì)傳統(tǒng)的檢測(cè)蚊法中的沉淀濃縮進(jìn)行了改進(jìn)，摸索出一種快速測(cè)定藻類(lèi)的方法，測(cè)定時(shí)間縮至當(dāng)天即可出結(jié)果，而且準(zhǔn)確、可靠，適用于生產(chǎn)和科研檢測(cè)。

1測(cè)定原理

利用測(cè)大腸菌的抽濾裝置，對(duì)檢測(cè)水樣進(jìn)行抽濾，藻類(lèi)被截留在濾膜（0.35—0.65μm）上，利用濾膜對(duì)藻細(xì)胞的吸附力并不強(qiáng)，用少量純水在HJ-3型電磁攪拌器上萃取4、5次就能將全部的藻細(xì)胞洗回水中。

濾膜的主要成分是硝化纖維素（CN）,可深于丙酮，而丙酮對(duì)藻細(xì)胞形狀基本沒(méi)影響，當(dāng)濾膜遇到丙酮后會(huì)變成透明膠液，不影響鏡下觀察檢測(cè)。

由于丙酮易揮發(fā)，濾膜變干會(huì)恢復(fù)原型，為了保證藻細(xì)胞和濾膜的濕度，考慮到丙酮和甘油的相容性，甘油的吸潮性及本身的油脂性，能使藻細(xì)胞和濾膜在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持濕潤(rùn)透明，因此，在丙酮溶劑中加了一定比例的甘油，但甘油太多，會(huì)影響濾膜的溶解。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1抽濾萃取法

取適量水樣，按100：1的量加魯哥試劑固定，在裝有濾膜的抽濾器上進(jìn)行抽濾。取下濾膜，放到100ml的小燒杯里，有藻細(xì)胞的一面朝上，加5—8ml純水；調(diào)好電磁攪拌器轉(zhuǎn)速，使液體攪拌時(shí)不會(huì)向上濺出，將小燒杯放到攪拌器上轉(zhuǎn)1mim左右，取洗液。

加入純水5—8ml純水；重復(fù)上步聚；振洗5次，定空洗液至50ml，在顯微鏡下記數(shù)，計(jì)算公工：

N=[(A/Ac)×（Vs/V·Va）]×n

式中，N為每升原水樣中的浮游植物數(shù)量（個(gè)·J-1）；A為計(jì)數(shù)框的體積（ml）；n為計(jì)數(shù)所得藻類(lèi)數(shù)目（個(gè)）。

2.2驗(yàn)證法

將上述實(shí)驗(yàn)洗凈后的濾膜放入一平面皿，在空調(diào)下或熱源邊（不要超過(guò)40℃）使濾膜稍干燥，將濾膜放一載玻片上，加二至四滴濾膜透明液，使膜完全溶解成透明膠液，蓋上蓋玻片，在CHK型顯微鏡下觀察。

此方法也可用來(lái)驗(yàn)證傳統(tǒng)沉淀法中的棄液藻細(xì)胞流失情況。

3?結(jié)果及分析

取已知數(shù)量的小球藻9.643×105·1-1，按上述方法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1，兩種方法在實(shí)際水樣中的應(yīng)用結(jié)果如表2所示。

傳統(tǒng)沉淀方法精確度低，平行樣相對(duì)偏關(guān)在+15％；測(cè)試時(shí)間較長(zhǎng)，根據(jù)理論推算，最小的藻為沉?xí)r間需要60?，我們實(shí)驗(yàn)靜置學(xué)時(shí)間為43H,常有一些較小的藻細(xì)胞隨棄液流失，而且在南方地區(qū)氣溫較高，藻細(xì)胞大都偏小，易發(fā)生流失現(xiàn)象，流失達(dá)30％以上。

抽濾萃取法能較好地阻止藻細(xì)胞流失，但由于濾敢太小，一般只能抽濾濁度10NTU以下的水，對(duì)于源水最多只能抽濾200ML左右的水量，太多則濾孔就會(huì)被堵?而難以達(dá)到抽濾效果，所以存在取水量較少，影響代表性，如有條件，濾膜孔徑可取在1.5－1.8M,對(duì)于低濁度的出廠水和濾后水，則不存在這個(gè)問(wèn)題，可抽濾200－300ml水量，而且能準(zhǔn)確地反映水中殘存藻細(xì)胞的數(shù)量。

傳統(tǒng)的沉淀方法中由于染色時(shí)間較長(zhǎng)，藻細(xì)胞和雜質(zhì)均被染成褐色，在鏡下觀察時(shí)，影響藻細(xì)胞的分?而抽濾萃取則沒(méi)有這種問(wèn)題，因?yàn)樵寮?xì)胞還保存著很好的原本色澤（絕大多數(shù)為綠色）和形狀，較容易與水中的細(xì)菌、真菌以及低等浮游動(dòng)物、顆粒、纖維等區(qū)分開(kāi)來(lái)。

3、藻類(lèi)葉綠素及其降解產(chǎn)物的測(cè)定方法

下文綜述了用分光光度法,熒光檢測(cè)法及高效液相色譜法測(cè)定藻類(lèi)葉綠素及其降解產(chǎn)物的方法.?分別詳細(xì)介紹了各種方法的設(shè)備,程序,計(jì)算公式及特點(diǎn).。此外,還介紹了藻類(lèi)類(lèi)胡蘿卜素的高效液相色譜測(cè)定方法。?按測(cè)定方法分為六個(gè)部分：(1)?葉綠素a?,?b?和c?的分光光度法測(cè)定(三色法)?;?(2)?葉綠素a?的熒光檢測(cè)法;?(3)?存在脫鎂葉綠素a?時(shí)葉綠素a?的分光光度法測(cè)定;?(4)?存在脫鎂葉綠素a?時(shí)葉綠素a?的熒光法測(cè)定;?(5)?高效液相色譜(HPLC)?測(cè)定藻類(lèi)的葉綠素及它們的降解產(chǎn)物;?(6)?HPLC?測(cè)定藻類(lèi)葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素。

藻類(lèi)的特異性色素是葉綠素、葉黃素和胡蘿卜素.?浮游藻類(lèi)里常見(jiàn)的三種葉綠素是葉綠素a?,b?和c.葉綠素a?在一切浮游藻類(lèi)里大約占有機(jī)物干重的1～2?%?,是估計(jì)藻類(lèi)生物量的好指標(biāo).?細(xì)胞的葉綠素含量隨種類(lèi)或類(lèi)群而有所不同,同時(shí)還受年齡、生長(zhǎng)率、光和營(yíng)養(yǎng)條件的影響.脫鎂葉綠素a?(一種葉綠素a?的普通降解產(chǎn)物)?能夠干擾葉綠素a?的測(cè)定,因?yàn)槿绻嬖诿撴V葉綠素a?,它能在葉綠素a?的相同光譜區(qū)吸收光和熒光,造成葉綠素a?值的誤差.?當(dāng)測(cè)定葉綠素a?的時(shí)候還要測(cè)定脫鎂葉綠素a.?葉綠素a?和脫鎂葉綠素a?之比可作為浮游植物生理?xiàng)l件的一個(gè)良好指標(biāo).下文綜述了用分光光度法,熒光檢測(cè)法及高效液相色譜法測(cè)定藻類(lèi)葉綠素及其降解產(chǎn)物的方法：

(1)?葉綠素a?,?b?和c?的分光光度法測(cè)定(三色法)?;

(2)?葉綠素a?的熒光檢測(cè)法;?

(3)?存在脫鎂葉綠素a時(shí),葉綠素a?的分光光度法測(cè)定;?

(4)?存在脫鎂葉綠素a?時(shí)葉綠素a?的熒光法測(cè)定;?

(5)?高效液相色譜測(cè)定藻類(lèi)的葉綠素及它們的降解產(chǎn)物;?(6)?HPLC?測(cè)定藻類(lèi)葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素.

1?葉綠素a?,?b?和c?的分光光度法測(cè)定(三色法)

用丙酮水溶液自浮游生物濃縮樣萃取色素,用分光光度計(jì)測(cè)定萃取物的吸光度.?葉綠素自細(xì)胞內(nèi)提出的難度,不同藻類(lèi)差異相當(dāng)大.?為了將色素完全萃出,通常需要用組織研磨器機(jī)械的破壞細(xì)胞.

111?　儀器和試劑

(1)?分光光度計(jì):用窄帶的(015～210nm)?.

(2)?1cm?,4cm?和10cm?光程的比色池.

(3)?醫(yī)用離心機(jī).

(4)?組織研磨器(最好使用圓底的研磨管和搗桿)?.

(5)?離心管:15ml?,有刻度和螺帽.

(6)?過(guò)濾設(shè)備:過(guò)濾器,濾膜(0145μm?孔徑,47mm?直徑)?或玻璃纖維過(guò)濾器(GFPC?或GFPA?,415cm?直徑)?,真空泵.

(7)MgCO3?懸浮液:在100ml?蒸餾水中加入110g?細(xì)粉末MgCO3?.

(8)?90?%(體積比)?丙酮水溶液.

112?　測(cè)定程序

(1)?離心或過(guò)濾濃縮水樣.?在離心前或過(guò)濾的最后一步加入012ml?MgCO3?懸浮液.

(2)?把樣品置入組織研磨器,用2～3ml?90?%丙酮水溶液覆蓋浸泡.

(3)?把樣品移入一個(gè)有螺帽的離心管,用幾毫升90?%丙酮水溶液洗研磨器,并把洗液加入到萃取液

中,用90?%丙酮水溶液調(diào)節(jié)體積到5～10ml?.

(4)?在蓋緊的離心管中于500g?離心20min?澄清萃取液,把澄清的萃取液傾入一支清潔的,標(biāo)定過(guò)的15ml?有螺帽的離心管并測(cè)定萃取液的總體積.

(5)?把萃取液移入1cm?的比色池,在750、663、645?和630nm?測(cè)定吸光度(OD)?.

113?　計(jì)算

葉綠素a?,b?和c?的測(cè)定分別使用663、645?和630nm?的吸光度.?750?nm?的讀數(shù)用來(lái)校正渾濁度.?將每個(gè)色素的OD?值中減去這個(gè)渾濁度校正值后,帶入下列公式計(jì)算濃度:

(1)?葉綠素a?(mgPl)?=?11164?(OD663?)?–?2116?(OD645?)?+?0110?(OD630?)

葉綠素b?(mgPl)?=?20197?(OD645?)?–?3194?(OD663?)?–?3166?(OD630?)

葉綠素c?(mgPl?)?=?54122?(OD630?)?–?14118?(OD645?)?–?5153?(OD663?)

(2)?各單位體積色素量的計(jì)算如下:

葉綠素a?(mgPm3?)?=?葉綠素a?(mgPl?)?×萃取液的總體積(l)?/?水樣體積(m3?)

2?葉綠素a?的熒光檢測(cè)法

葉綠素a?的熒光檢測(cè)法比分光光度法靈敏,需樣品較少.?而且不要求像分光光度法那樣的波長(zhǎng)分辨率,在430nm?的激發(fā)波長(zhǎng)和在663nm?的發(fā)射波長(zhǎng)抽取在試管內(nèi)測(cè)定葉綠素a?可過(guò)的最佳靈感度.

211?　儀器和試劑

(1)?熒光計(jì),備有高強(qiáng)度F4?T.?5?藍(lán)光燈,光電倍增管R?–?136?(紅敏)?,可滑動(dòng)窗孔,光發(fā)射(CS?–?2?–?64)

和光激發(fā)(CS?–?5?–?60)?濾光片,以及一個(gè)高靈敏度門(mén).

(2)?其他設(shè)備和試劑同111

212?　測(cè)定程序

(1)?　用已知濃度的葉綠素溶液標(biāo)定熒光計(jì):

用分光光度法測(cè)定濃度約為2、6、20?和60μgPl?的葉綠素a?萃取液,再在每一靈敏度位置對(duì)每一溶液進(jìn)行讀數(shù),導(dǎo)出標(biāo)定系數(shù)Fs

Fs?=?CaPRs

式中　Fs?———靈敏度位置S?的標(biāo)定系數(shù)

Rs?———靈敏度位置S?的熒光計(jì)讀數(shù)

Ca?———分光光度法測(cè)定的葉綠素a?濃度(μgPl)

(2)?　在能夠取得適中讀數(shù)的各靈敏度位置測(cè)定樣品的熒光,將讀數(shù)乘以適當(dāng)?shù)臉?biāo)定系數(shù),得到葉綠素a?濃度..

3?　存在脫鎂葉綠素a?時(shí)葉綠素a?的分光光度法測(cè)定

由于脫鎂葉綠素在接近葉綠素a?相同的波長(zhǎng)上有吸收,因而含有脫鎂葉綠素時(shí)葉綠素a?的測(cè)定值可能偏高.?葉綠素a?由于酸化作用變成脫鎂葉綠素a?,吸收峰的值比原來(lái)大約降低40?%?,并從663nm?移至665nm?,酸化前后產(chǎn)生的吸收峰之比為1170?,可用來(lái)表觀葉綠素a?的濃度作脫鎂葉綠素a?的校正.

311?　儀器和試劑

(1)?同111

(2)?HCl?1mol·L?–?1

312?　測(cè)定程序

(1)?用90?%丙酮水溶液萃取色素,離心澄清,在750、663nm?讀取OD?值.

(2)?在1cm?的比色池中用兩滴1mol·L?–?1?HCl?酸化萃取液,輕輕攪拌1～2min?后在750、665nm?讀取OD?值.

(3)?酸化前OD663和酸化后OD665值都減去OD750值.

313?　計(jì)算

使用校正過(guò)的值計(jì)算葉綠素a?濃度(C)?與脫鎂葉綠素a?濃度(P)

C(mgPm3?)?=?26173?(663b?–?665a)V1PV2L

P(mgPm3?)?=?26173[117?(665a)?–?663b?]V1PV2L

式中V1?———萃取液的體積(l)

V2?———水樣的體積(m3?)

L?———比色皿液層厚度(cm)

663b?,665a?分別為酸化前后90?%丙酮水溶液萃取的吸光度.

26173?是吸光度校正

4?存在脫鎂葉綠素a?時(shí)葉綠素a?的熒光法測(cè)定

用熒光法測(cè)定脫鎂葉綠素a?的濃度,需要測(cè)定酸化前后丙酮萃取液的熒光.?葉綠素a?由于酸化后變成脫鎂葉綠素a?,致使熒光降低,利用這一原理進(jìn)行測(cè)定萃取液的脫鎂葉綠素a?濃度.

411?　儀器和試劑

(1)?同21a

(2)?HCl?1mol·L?–?1

(3)?純?nèi)~綠素a

412?　測(cè)定程序

校準(zhǔn)熒光計(jì),在每一靈敏度位置測(cè)定酸化前后萃取液的熒光.?計(jì)算校準(zhǔn)系數(shù)(Fs?)?,用酸化前的熒光讀數(shù)除以酸化后的熒光讀數(shù),算出酸化前后的熒光比.

413?　計(jì)算

葉綠素a?(mgPm3?)?=?Fs?(Rb?–?Ra)?rP(r?–?1)

脫鎂葉綠素a?(mgPm3?)?=?Fs?(rRa?–?Rb)?rP(r?–?1)

式中　Fs?———靈敏度位置S?的換算系數(shù)

Rb?———萃取液酸化前的熒光

Ra?———萃取液酸化后的熒光

r?———RbPRa

5?　高效液相色譜測(cè)定藻類(lèi)的葉綠素及它們的降解產(chǎn)物

511?　儀器和試劑

除色素提取物外還包括:

(1)?高效液相色譜儀,流速為210mlPm.

(2)?裝有100?微升進(jìn)樣環(huán)管的高壓進(jìn)樣閥.

(3)?保護(hù)柱(410?3?015cm?,?C18?,?3μm)

(4)?反相HPLC?柱(C18?,?10cm?,?3μm)

(5)?熒光檢測(cè)器,波長(zhǎng)為430?±30nm?,可發(fā)射超過(guò)600nm?熒光.

(6)?數(shù)據(jù)紀(jì)錄裝置,長(zhǎng)條紙記錄器或電子積分儀.

(7)?注射器,玻璃,250μL

(8)?HPLC?洗脫劑:洗脫劑A(80∶15∶5?;甲醇∶Ⅰ型試劑∶離子對(duì)溶液)?,洗脫劑B(80∶20?;甲醇∶丙酮)?.

(9)?校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物:分別將1ml?純?nèi)~綠素a?和b?溶于100ml?90?%丙酮中,用分光光度法測(cè)定其準(zhǔn)確濃度.?用上述葉綠素a?和b?標(biāo)準(zhǔn)物經(jīng)鹽酸酸化后制得脫鎂葉綠素a?+?a′和b?+?b′標(biāo)準(zhǔn)物;從硅藻中萃取葉綠素c?和脫植基葉綠素a?,酸化脫植基葉綠素a?制得脫鎂葉綠素酸a?,分別用薄層色譜法(TLC)?純化,分光光度法校準(zhǔn),作為標(biāo)準(zhǔn)物.

512?　測(cè)定程序

(1)?用洗脫劑A?,流速為210mlPm?,建立和平衡HPLC?系統(tǒng);校準(zhǔn)熒光計(jì)的感光度,用葉綠素a?標(biāo)樣的濃度最大值作為滿(mǎn)刻度.

(2)?通過(guò)先前制備的標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)HPLC?系統(tǒng)的工作標(biāo)準(zhǔn).?分別混合葉綠素與脫植基葉綠素a?,脫鎂葉綠素a?和脫鎂葉綠素酸a?,作為混合標(biāo)準(zhǔn)物.?混合1ml?標(biāo)準(zhǔn)液與300μL?離子對(duì)溶液,平衡5?分鐘后進(jìn)樣.?混合1ml?90?%丙酮與300μL?離子對(duì)溶液作為空白液.?用150μL?標(biāo)準(zhǔn)液漂洗注射器2?次,注射器中吸入250μL?標(biāo)準(zhǔn)液用于進(jìn)樣,將注射器插入進(jìn)樣閥,充滿(mǎn)100μL?的進(jìn)樣環(huán)管.?建立標(biāo)準(zhǔn)色素濃度與熒光峰面積(或高)?的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

(3)?混合1ml?90?%丙酮色素提取物與300μL?離子對(duì)溶液,作為進(jìn)樣樣品.

(4)?使用兩步溶劑程序,用于優(yōu)化葉綠素及其降解產(chǎn)物的分離.?進(jìn)樣后,5?分鐘內(nèi)將洗脫劑A?轉(zhuǎn)變?yōu)橄疵搫?/span>B?,維持B15?分鐘,流速為210mlPm.?在下一次進(jìn)樣前,需用洗脫劑A?重新平衡色譜柱5?分鐘.?總分析時(shí)間約為25?分鐘.

(5)?用下列公式計(jì)算各色素的濃度

Ci?=?AsFiVe

PVEVs

式中　Ci?=?各色素的濃度mgPl

As?=?各次進(jìn)樣的色素峰面積

Fi?=?標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)因子

Ve?=?進(jìn)樣體積(011ml)

VE?=?萃取體積(ml)

Vs?=?樣品體積(l)

(6)?這種方法僅用于葉綠素及其降解產(chǎn)物的定量.

(7)?檢測(cè)限隨熒光計(jì)結(jié)構(gòu)與流速而變,但對(duì)于大多數(shù)葉綠素與它們的降解產(chǎn)物來(lái)說(shuō),每次進(jìn)樣檢測(cè)限范圍在10～100pg.?HPLC?法的精確度主要取決于色素標(biāo)準(zhǔn)樣的純度.?更理想的方法是測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣的吸收光譜(350～750nm)?并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相比較.?色素的純度也可用HPLC?法來(lái)測(cè)定,條件是不存在能與標(biāo)準(zhǔn)物的吸收和熒光譜帶相重疊的共洗脫污染物.?如果分光光度法測(cè)得的數(shù)據(jù)經(jīng)脫鎂色素校正,HPLC?的結(jié)

果表達(dá)為色素當(dāng)量(例如:葉綠素a?當(dāng)量=?脫植基葉綠素a?+?葉綠素a?+?葉綠素a′,假定使用正確的分子量校正值)?,那么HPLC?法與分光光度法提供的色素濃度與提供的EPA?標(biāo)準(zhǔn)符合得很好.?因此如果明顯的存在色素衍生物,用分光光度法測(cè)得的數(shù)據(jù)會(huì)偏高.?要HPLC?法與熒光法測(cè)得的數(shù)據(jù)一致則取決于附加的葉綠素b?,c?和它們的衍生物.

6?　HPLC?測(cè)定藻類(lèi)葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素

611?　儀器和試劑

除色素提取物外還包括:

(1)?高效液相色譜泵,可進(jìn)行三種不同溶劑的梯度輸出,流速為110mlPm.

(2)?裝有200?微升進(jìn)樣環(huán)管的高壓進(jìn)樣閥.

(3)?保護(hù)柱.?(50?3?416mm?,C18?,5μm)

(4)?封尾的反相色譜柱(250?3?416mm?,5μm?,C18?)?.

(5)?可變波長(zhǎng)或過(guò)濾吸光度檢測(cè)器,帶有低體積流通池,檢測(cè)波長(zhǎng)為436nm.

(6)?數(shù)據(jù)紀(jì)錄裝置.

(7)?注射器,玻璃,500μL

(8)?HPLC?洗脫劑:洗脫劑A(80∶20?;?甲醇∶015M乙酸銨,pH?712)?,洗脫劑B(90∶10?;乙腈∶水)?,洗脫劑C(乙酸乙酯)?.

(9)?校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物:葉綠素a?和b?,β,β2胡蘿卜素可購(gòu)買(mǎi).?其他色素標(biāo)準(zhǔn)物可用TLC?或制備級(jí)HPLC?從植物提取物種純化得到.?在校準(zhǔn)HPLC?系統(tǒng)前,在專(zhuān)用溶劑中使用裝有單色器的分光光度計(jì)測(cè)定所有標(biāo)準(zhǔn)物的濃度.?使用公式:

Ci?=?1000?(Aλmax-?A750nm)PE1cmb

式中　Ci?=?各色素的濃度mgPl

A?=?特定波長(zhǎng)下的吸光度

E?=?吸光系數(shù)lPgcm

b?=?比色池長(zhǎng)度cm

612?　測(cè)定程序

(1)?用洗脫劑A?,流速為110?mlPm?,建立和平衡HPLC?系統(tǒng);

(2)?通過(guò)先前制備的標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)HPLC?系統(tǒng)的工作標(biāo)準(zhǔn).?混合1ml?標(biāo)準(zhǔn)物與300μL?蒸餾水,搖動(dòng),平衡5?分鐘后進(jìn)樣.?用300μL?標(biāo)準(zhǔn)液漂洗注射器2?次,注射器中吸入500μL?標(biāo)準(zhǔn)液用于進(jìn)樣,將注射器插入進(jìn)樣閥,充滿(mǎn)200μL?的進(jìn)樣環(huán)管.?混合1ml?90?%丙酮與300μL?蒸餾水作為空白液.?建立標(biāo)準(zhǔn)色素濃度與熒光峰面積(或高)?的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

(3)?混合1ml90?%丙酮色素提取物與300μL?蒸餾水,作為進(jìn)樣樣品.

(4)?樣品進(jìn)樣采用梯度程序用以?xún)?yōu)化葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素的分離.

(5)?通過(guò)比較樣品峰與純標(biāo)準(zhǔn)物峰的保留時(shí)間來(lái)定性.

(6)?濃度的計(jì)算方法同512.?(5)

(7)?這種方法為葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素的分離而設(shè)計(jì),同時(shí)也可以分離主要的葉綠素分解產(chǎn)物.?方法的精確度由測(cè)定三倍進(jìn)樣的浮游植物群落和植物的提取物確定.?使用合適的內(nèi)標(biāo)物可提高精確度.